IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) β-galactosidase substrate کا ایک analogue ہے، جو انتہائی inducible ہے۔IPTG کی شمولیت کے تحت، inducer repressor پروٹین کے ساتھ ایک کمپلیکس تشکیل دے سکتا ہے، تاکہ repressor پروٹین کی شکل بدل جائے، تاکہ اسے ہدف والے جین کے ساتھ ملایا نہ جا سکے، اور ہدف کے جین کا موثر انداز میں اظہار کیا جائے۔تو تجربے کے دوران IPTG کی حراستی کا تعین کیسے کیا جائے؟کیا بڑا بہتر ہے؟
سب سے پہلے، آئی پی ٹی جی انڈکشن کے اصول کو سمجھیں: ای کولی کے لییکٹوز اوپیرون (عنصر) میں تین ساختی جینز، Z،Y، اور A ہوتے ہیں، جو بالترتیب β-galactosidase، permease اور acetyltransferase کو انکوڈ کرتے ہیں۔lacZ لییکٹوز کو گلوکوز اور galactose، یا allo-lactose میں ہائیڈولائز کرتا ہے۔lacY ماحول میں لییکٹوز کو سیل کی جھلی سے گزر کر سیل میں داخل ہونے دیتا ہے۔lacA ایسٹیل گروپ کو ایسٹیل-CoA سے β-galactoside میں منتقل کرتا ہے، جس میں زہریلے اثر کو ہٹانا شامل ہے۔اس کے علاوہ، ایک آپریٹنگ سیکوینس O، ایک ابتدائی ترتیب P اور ایک ریگولیٹری جین I ہے۔ I جین کوڈ ایک ریپریسر پروٹین ہے جو آپریٹر ترتیب کی پوزیشن O سے منسلک ہو سکتا ہے، تاکہ اوپرون (میٹا) کو دبایا جائے اور بند کر دیا گیا.ابتدائی ترتیب P کے اوپر کیٹابولک جین ایکٹیویٹر پروٹین-CAP بائنڈنگ سائٹ کے لیے ایک بائنڈنگ سائٹ بھی ہے۔ P تسلسل، O تسلسل اور CAP بائنڈنگ سائٹ مل کر لاک اوپیرون کا ریگولیٹری خطہ تشکیل دیتے ہیں۔جین کی مصنوعات کے مربوط اظہار کو حاصل کرنے کے لیے تینوں خامروں کے کوڈنگ جینز کو ایک ہی ریگولیٹری خطے کے ذریعے منظم کیا جاتا ہے۔
لییکٹوز کی عدم موجودگی میں، لاک اوپیرون (میٹا) جبر کی حالت میں ہے۔اس وقت، PI پروموٹر کی ترتیب کے زیر کنٹرول I ترتیب کے ذریعے ظاہر ہونے والا لاکھ ریپریسر O ترتیب سے منسلک ہوتا ہے، جو RNA پولیمریز کو P ترتیب سے منسلک ہونے سے روکتا ہے اور نقل کی شروعات کو روکتا ہے۔جب لییکٹوز موجود ہوتا ہے، تو لاک اوپیرون (میٹا) کو انڈس کیا جا سکتا ہے اس اوپیرون (میٹا) سسٹم میں، اصل انڈیسر خود لییکٹوز نہیں ہے۔لییکٹوز سیل میں داخل ہوتا ہے اور β-galactosidase کے ذریعے اتپریرک ہوتا ہے تاکہ اسے allolactose میں تبدیل کیا جا سکے۔مؤخر الذکر، ایک انڈیسر مالیکیول کے طور پر، ریپریسر پروٹین سے منسلک ہوتا ہے اور پروٹین کی شکل میں تبدیلی لاتا ہے، جو O تسلسل اور نقل سے ریپریسر پروٹین کو الگ کرنے کا باعث بنتا ہے۔Isopropylthiogalactoside (IPTG) کا وہی اثر ہے جو allolactose ہے۔یہ ایک بہت ہی طاقتور inducer ہے، جو بیکٹیریا کے ذریعے میٹابولائز نہیں ہوتا اور بہت مستحکم ہوتا ہے، اس لیے یہ لیبارٹریوں میں بڑے پیمانے پر استعمال ہوتا ہے۔
IPTG کی زیادہ سے زیادہ حراستی کا تعین کیسے کریں؟مثال کے طور پر ای کولی کو لیں۔
E. coli BL21 جینیاتی طور پر انجینئرڈ سٹرین جس میں مثبت ریکومبیننٹ pGEX (CGRP/msCT) ہوتا ہے LB مائع میڈیم میں ٹیکہ لگایا گیا تھا جس میں 50μg·mL-1 Amp تھا، اور راتوں رات 37°C پر کلچر کیا گیا تھا۔مندرجہ بالا کلچر کو توسیعی کلچر کے لیے 1:100 کے تناسب سے 50μg·mL-1 Amp پر مشتمل 50mL تازہ LB مائع میڈیم کی 10 بوتلوں میں ٹیکہ لگایا گیا، اور جب OD600 کی قدر 0.6~0.8 تھی، IPTG کو حتمی حراستی میں شامل کیا گیا۔یہ 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1 ہے۔ایک ہی درجہ حرارت اور ایک ہی وقت میں شامل کرنے کے بعد، بیکٹیریل محلول کا 1 ملی لیٹر اس سے لیا گیا، اور بیکٹیریل خلیات کو سینٹرفیوگریشن کے ذریعے جمع کیا گیا اور پروٹین کے اظہار پر مختلف IPTG ارتکاز کے اثر و رسوخ کا تجزیہ کرنے کے لیے SDS-PAGE کے تابع کیا گیا، اور پھر سب سے بڑے پروٹین اظہار کے ساتھ IPTG ارتکاز کا انتخاب کریں۔
تجربات کے بعد، یہ پتہ چل جائے گا کہ IPTG کا ارتکاز اتنا بڑا نہیں ہے جتنا ممکن ہو۔اس کی وجہ یہ ہے کہ IPTG بیکٹیریا کے لیے ایک خاص زہریلا ہے۔ارتکاز سے زیادہ سیل کو بھی ہلاک کردے گا۔اور عام طور پر، ہم امید کرتے ہیں کہ سیل میں جتنی زیادہ حل پذیر پروٹین کا اظہار کیا جائے گا، اتنا ہی بہتر ہے، لیکن بہت سے معاملات میں جب IPTG کا ارتکاز بہت زیادہ ہوتا ہے، بڑی مقدار میں شمولیت تشکیل دی جائے گی۔جسم، لیکن گھلنشیل پروٹین کی مقدار میں کمی آئی.لہذا، سب سے زیادہ مناسب IPTG ارتکاز اکثر بہتر نہیں ہوتا ہے، لیکن ارتکاز کم ہوتا ہے۔
جینیاتی طور پر انجنیئرڈ اسٹرینز کو شامل کرنے اور کاشت کرنے کا مقصد ہدف پروٹین کی پیداوار میں اضافہ اور اخراجات کو کم کرنا ہے۔ہدف جین کا اظہار نہ صرف تناؤ کے اپنے عوامل اور اظہار پلازمڈ سے متاثر ہوتا ہے، بلکہ دیگر بیرونی حالات سے بھی متاثر ہوتا ہے، جیسے inducer کا ارتکاز، انڈکشن درجہ حرارت اور شامل کرنے کا وقت۔لہذا، عام طور پر، کسی نامعلوم پروٹین کو ظاہر کرنے اور پاک کرنے سے پہلے، مناسب حالات کو منتخب کرنے اور بہترین تجرباتی نتائج حاصل کرنے کے لیے انڈکشن ٹائم، درجہ حرارت اور آئی پی ٹی جی کے ارتکاز کا مطالعہ کرنا بہتر ہے۔
پوسٹ ٹائم: دسمبر-31-2021