Dithiothreitol (DTT) عام طور پر استعمال ہونے والا کم کرنے والا ایجنٹ ہے، جسے نیو گرین ایڈیٹیو بھی کہا جاتا ہے۔یہ ایک چھوٹا سالماتی نامیاتی مرکب ہے جس میں دو مرکاپٹن گروپس (-SH) ہیں۔اس کی خصوصیات کو کم کرنے اور استحکام کی وجہ سے، ڈی ٹی ٹی کو بائیو کیمسٹری اور سالماتی حیاتیات کے تجربات میں بڑے پیمانے پر استعمال کیا جاتا ہے۔
ڈی ٹی ٹی کا بنیادی کردار پروٹین اور دیگر بائیو مالیکیولز میں ڈسلفائیڈ بانڈز کو کم کرنا ہے۔ڈسلفائیڈ بانڈ پروٹین کی تہہ اور استحکام کا ایک اہم حصہ ہے، لیکن بعض تجرباتی حالات کے تحت، جیسے کہ قابل تخفیف SDS-PAGE تجزیہ، پروٹین کا دوبارہ ملاپ اور فولڈنگ، اس کے مقامی ڈھانچے کو کھولنے کے لیے ڈسلفائیڈ بانڈ کو دو تھیول گروپس میں کم کرنا ضروری ہے۔ پروٹینڈی ٹی ٹی ڈائسلفائیڈ بانڈز کے ساتھ رد عمل ظاہر کر کے انہیں مرکپٹن گروپس میں کم کر سکتا ہے، اس طرح پروٹین کے مقامی ڈھانچے کو کھولتا ہے اور اس کا تجزیہ اور ہیرا پھیری کرنا آسان ہو جاتا ہے۔
ڈی ٹی ٹی کو انزائم کی سرگرمی اور استحکام کی حفاظت کے لیے بھی استعمال کیا جا سکتا ہے۔کچھ انزائم کیٹلیزڈ رد عمل میں، انزائم کی سرگرمی آکسیڈینٹ کے ذریعے کم ہو سکتی ہے۔ڈی ٹی ٹی آکسیڈنٹس کے ساتھ رد عمل ظاہر کر کے انہیں نقصان دہ مادوں تک کم کر سکتا ہے، اس طرح انزائم کی سرگرمی اور استحکام کی حفاظت کرتا ہے۔
روایتی کم کرنے والے ایجنٹوں جیسے کہ β-mercaptoethanol (β-ME) کے مقابلے میں، DTT کو ایک محفوظ اور زیادہ مستحکم کم کرنے والا ایجنٹ سمجھا جاتا ہے۔یہ نہ صرف پانی کے محلول میں مستحکم ہے، بلکہ اعلی درجہ حرارت اور تیزاب کی بنیاد کے حالات میں بھی اپنی کم کرنے والی خصوصیات کو برقرار رکھتا ہے۔
ڈی ٹی ٹی کا استعمال نسبتاً آسان ہے۔عام طور پر، ڈی ٹی ٹی کو ایک مناسب بفر میں تحلیل کیا جاتا ہے اور پھر تجرباتی نظام میں شامل کیا جاتا ہے۔DTT کی زیادہ سے زیادہ ارتکاز کا تعین مخصوص تجربے کے مطابق کرنے کی ضرورت ہے، اور اسے عام طور پر 0.1-1mM کی حد میں استعمال کیا جاتا ہے۔کم ارتکاز سیل کی نشوونما پر منفی اثرات کو کم کر سکتا ہے اور ٹارگٹ پروٹینز کے زیادہ اظہار کی وجہ سے سائٹوٹوکسیٹی کو کم کر سکتا ہے۔زیادہ ارتکاز سیل میٹابولک بوجھ کا سبب بن سکتا ہے، جس سے سیل کی نشوونما اور اظہار کی کارکردگی متاثر ہوتی ہے۔
زیادہ سے زیادہ ارتکاز کا تعین کرنے کا طریقہ مختلف ارتکاز پر IPTG انڈکشن ٹیسٹ کروا کر ہدف پروٹین کے اظہار کی سطح کا اندازہ لگا سکتا ہے۔چھوٹے پیمانے پر کلچر ٹیسٹ IPTG ارتکاز کی ایک رینج (مثلاً 0.1 mM، 0.5 mM، 1 mM وغیرہ) کا استعمال کرتے ہوئے کئے جا سکتے ہیں اور مختلف ارتکاز پر اظہار اثر کا اندازہ ہدف پروٹین کے اظہار کی سطح کا پتہ لگا کر کیا جا سکتا ہے (مثلاً مغربی دھبہ یا فلوروسینس کا پتہ لگانا)۔تجرباتی نتائج کے مطابق، بہترین اظہار اثر کے ساتھ ارتکاز کو بہترین ارتکاز کے طور پر منتخب کیا گیا۔
اس کے علاوہ، آپ متعلقہ لٹریچر یا دیگر لیبارٹریز کے تجربے کا بھی حوالہ دے سکتے ہیں تاکہ اسی طرح کے تجرباتی حالات میں عام طور پر استعمال ہونے والے IPTG ارتکاز کی حد کو سمجھ سکیں، اور پھر تجرباتی ضروریات کے مطابق اصلاح اور ایڈجسٹ کریں۔
یہ نوٹ کرنا ضروری ہے کہ زیادہ سے زیادہ ارتکاز مختلف ایکسپریشن سسٹمز، ٹارگٹ پروٹینز، اور تجرباتی حالات کے لحاظ سے مختلف ہو سکتا ہے، اس لیے ہر معاملے کی بنیاد پر اصلاح کرنا بہتر ہے۔
خلاصہ یہ کہ ڈی ٹی ٹی عام طور پر استعمال ہونے والا کم کرنے والا ایجنٹ ہے جسے پروٹین اور دیگر بائیو مالیکیولز میں ڈسلفائیڈ بانڈز کو کم کرنے اور انزائم کی سرگرمی اور استحکام کی حفاظت کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔یہ بائیو کیمسٹری اور سالماتی حیاتیات کے تجربات میں بڑے پیمانے پر استعمال ہوتا رہا ہے۔
پوسٹ ٹائم: ستمبر-28-2023